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α突触核蛋白PD建模, 超声处理，电镜操作全知道

人阅读发布时间：2022-12-16 05:17

直接注射蛋白就可以建立帕金森（Parkinson's disease，下文简称为 PD）小鼠模型？听起来好高大上！

那么具体需要如何操作呢？很简单，就像字面上说的一样，直接注射！

听到这里，作为思维缜密操作严谨的科研人，可能还是会保持观望态度，毕竟做科研不是过家家，所谓「捷径」当然也有相应的注意事项，下面就一起来看一下具体操作吧！是否比你想象中简单呢～

本方法采用 StressMarq 1 型小鼠源前体纤维原（PFFs）（SPR-324）或 1 型人源 PFFs（SPR-322）注射到大鼠脑中来产生 α 突触核蛋白病理特征。其中小鼠 PFFs 显示出了更强的聚集效果，如图：

图 1. 注射了 1 型小鼠 α-突触核蛋白 PFFs （SPR-324）的大鼠脑免疫组织化学分析。实验物种：Sprague-Dawley 大鼠（母）。大鼠脑中两个注射点分别为 AP + 1.6，ML + 2.4，DV - 4.2 和 AP - 1.4，ML + 0.2，DV - 2.8。每个注射点注射 16 µg 1 型小鼠 α-突触核蛋白 PFFs （SPR-324）。免疫組化分析取自注射后第 30 天。固定: 生理盐水灌注后 4% PFA 固定 48 小时，二抗选用生物素-SP 驴抗兔 IgG（H + L），稀释度 1:500 在冷室中震荡孵育 2 小时。ABC 信号放大，DAB 染色，放大倍数 20X。α-突触核蛋白病理症状可见于梨状/岛叶皮质和扣带皮层中，并且在注射点的同侧（ipsi）和相反侧（contra）都可以观察到。

（图片来源：StressMarq）

图 1 的注释中，就已经可以看到建模的操作步骤：

在以下两个脑顶叶区的头骨位置，分别注射 16 µg PFFs 或者单体（阴性对照）：

AP + 1.6，ML + 2.4，DV – 4.2

AP – 1.4，ML + 0.2，DV – 2.8

30 天后，用生理盐水灌注大鼠然后在大鼠脑冠状平面切开，将中脑与前脑分开后分别用 4% PFA 固定 48 小时。之后的步骤其实就是制作切片了，感兴趣的童鞋可以戳这里

需要注意的是，在注射之前，PFFs 和单体都要进行超声处理，而这也是大家比较常问的问题，超声处理用水浴还是探头？功率多少？超声多久？由于每个实验室仪器及实验条件不同，并没有一个一劳永逸的黄金法则，但是可以给到大家我们的实验经验。

几类超声仪中，非接触式超声波破碎仪是目前我们用过效果比较满意的，我们实验室的参数设置为：使用 1.5 ml 离心管加盖，至少100 μL 样本体积，30 秒开, 30 秒停，5 个高频循环。如果没有这类超声仪，我们还有其它仪器参数供参考：

第一种水浴超声破碎仪：使用 0.5 mL 离心管超声处理大概 10 μL 样本（5 mg/mL），持续 1 小时。

第二种水浴超声破碎仪：10ºC 下使用 80% 波幅（30 秒停，30 秒开，30 个循环）。

探头型超声破碎仪：20% 的功率，60 个 0.5 秒脉冲，每十个脉冲停顿 5 秒。

还是要再强调，由于每个实验室仪器及实验条件不同，建议大家根据具体情况优化自己的操作步骤，超声处理后做一下沉降测试（sedimentation assay），确保大部分蛋白都溶解于上清液中，或者用电镜（EM）来确认是否已经处理到位，通常来讲超声处理后原纤维的平均长度应该在 50 nm 左右。

既然提到了电镜验证，那么我们也来一起看一下电镜操作步骤吧！

和超声处理一样，由于每个实验室仪器及实验条件不同，建议大家根据具体情况优化自己的操作步骤。下面也和大家分享一下小编的经验，一般使用较多的是标准醋酸铀酰阴性染色法（standard uranyl acetate negative staining）。高清模式的网格（grid）成像可以使得原纤维在镜下清晰可见。且根据样本稀释倍数不同，目标区域可以进行相应的放大。

操作步骤如下：

1. 解冻样品，样品浓度 1 mg/mL；

2. 取 10 μl 样品置于网格上，放置 1 min 使其干燥（或用滤纸吸干）；

3. 加 10 μl dH₂O 于网格上，放置干燥；

4. 加 10 μl 2% 乙酸双氧铀于网格，等待 30 s 使其干燥；

5. 再加 10 μl 2% 乙酸双氧铀到网格上，等待 1 min 使其干燥；

6. 待网格自然风干几分钟后在 120 kV 观察成像。