随着全球老龄化严重，神经衰退疾病引起了越来越多的关注，其中阿尔兹海默症（AD）是最为人们熟知的一种。多年来，全球药企在AD药物研发投入6千亿美元¹，却大都以失败告终，但是由于该病严重影响患者的老年生活并且治疗花费巨大，AD的科研和药物研发投入从未减少。而基于神经衰退疾病的复杂成因，目前都没有有效的治疗方案，甚至病理进程还没有被完全了解。研究AD过程中，最早引起科研学者们注意的相关蛋白是β淀粉样肽，相信熟知AD的人对这类蛋白并不陌生，它出现在AD病人的大脑斑块中，被认为是导致神经元变性甚至死亡的原因²，因此最初的药物和治疗方案都是针对该蛋白。然而令人失望的是基于β淀粉样肽的新药研发全军覆没，于是更多的研究重点又放在了tau蛋白上。不过随着越来越深入的研究，科研学者们发现该病可能不是单纯的某一个蛋白的作用，而是两种蛋白同时出现问题而共同导致的疾病进程³，所以对β淀粉样肽的研究也不能放下，两种蛋白的研究双管齐下。  β淀粉样蛋白简称Aβ，它是淀粉样肽前体蛋白 (APP) 的水解产物，APP是一种跨膜整合蛋白，存在于多种组织当中，尤其是在AD中有重要角色的神经元突触⁴。APP蛋白水解之后释放Aβ，而后聚集沉积，是淀粉样斑块的主要成分。Aβ和tau蛋白以及α突触核蛋白都有类似的蛋白聚集机制，从单体到寡聚体再到原纤维，然后可以像种子一样诱导更多单体形成原纤维/聚集体。 Aβ肽，也就是单体，主要有两种形式Aβ40 and Aβ42，前者在正常老年人和AD患者脑中含量丰富，而后者主要存在于AD患者脑中5。Aβ42非常不稳定且极其容易聚集，导致研究它的各种结构（单体，寡聚体，原纤维）非常困难6。由于Aβ1-42在水溶液中是无结构的，而非极性溶剂可以诱导α螺旋结构7，所以目前市面上常用的是HFIP（1,1,1,3,3,3-六氟-2-bing醇，一种非极性溶剂）处理的Aβ肽，使之稳定于单体状态。当HFIP中水的含量增加时，α螺旋开始变成β折叠⁷，也就是聚集过程的开始，因此Aβ单体在运输和储藏过程中时干粉状态，需要防潮，避免水份的加入。

StressMarq的β淀粉样肽1-42 (Aβ42) 为合成肽，并在干燥前用 HFIP处理，从而可以分解前体原纤维并使肽单体化，一些文献中也使用的该方法^8,9。在 DMSO/dH2O 中重新悬浮后，当在 TEM、AFM 和具有抗Aβ 抗体的蛋白质印迹下观察时，我们的 Aβ42 呈现为不含原纤维的单体肽。与 Aβ42 寡聚体和原纤维相比，我们的 Aβ42 单体对原代大鼠皮层神经元没有毒性。

图1. 从左至右分别为Aβ单体 (SPR-485)，寡聚体 (SPR-488) 和原纤维 (SPR-487) 的电镜图。负染色透射电子显微镜图像在 80 Kv 下在碳涂层的 400 目铜网格上使用磷钨酸和乙酸双氧铀染色获得。比例尺 = 100 nm。

图2. 从左至右分别为Aβ单体 (SPR-485)，寡聚体 (SPR-488) 和原纤维 (SPR-487) 的原子力显微镜图。将1.0 mg/mL样品在 dH2O 中稀释至 0.1 mg/mL 置于新鲜切割的云母上，清洗、干燥并以轻敲模式进行原子力显微镜分析。上图为 2.5 x 2.5 µm x-y，z 范围为 10 nm。
 
淀粉样斑块的出现一直被认为是AD疾病的象征，但是它出现的数量和节奏都与AD疾病的进程不符，所以今年来研究学者们发现推动疾病进程的可能更多的是Aβ寡聚体和原纤维。制作寡聚体和原纤维的步骤在很多文献都有描述^8-10.

StressMarq 的Aβ42寡聚体使用Aβ肽由特殊方法制得，F12细胞培养基方法也在投入生产。我们的Aβ42寡聚体在电子 (图1) 和原子力 (图2) 显微镜下显示出明显的球状结构，而在WB (图3) 中使用抗Aβ抗体显示出独特的二聚体/三聚体和寡聚体信号。同时我们的Aβ寡聚体对原代大鼠皮质神经元有毒性 (图4)。Aβ42 原纤维使用Aβ肽由HCl方法制得，在电子 (图1) 和原子力 (图2) 显微镜下显示出明显的长链状结构，而在WB (图3) 中使用抗Aβ抗体显示出独特的高分子量信号。同时我们的Aβ原纤维对原代大鼠皮质神经元有毒性 (图4)。

 图3. 从左至右分别是Aβ单体 (SPR-485)，寡聚体 (SPR-488) 和原纤维 (SPR-487) 的WB，抗体是抗Aβ6E10抗体。三种Aβ蛋白 (160 pmol) 在 4-12% Bis-Tris SDS-PAGE 上跑胶后，在 0.02% v/v Tween-20 存在下转移到硝酸纤维素上，并用 1:1000 小鼠 6E10 一抗做WB。在 TEM/AFM 下观察到的寡聚体显示出明显的二聚体/三聚体条带以及来自 ~37-75 kDa 的信号（中）。在 TEM/AFM 下观察到的原纤维显示出大于 100 kDa 的信号，并且在浓缩胶（右）中有明显的信号。

StressMarq的Aβ单体，寡聚体和原纤维都可以应用于WB，以及体内和体外实验。 Tau 蛋白为大家所熟知是因为它是阿尔茨海默症 (AD) 的标志性蛋白，科研界对它的关注度仅次于β-淀粉样肽，而近年来因为基于β-淀粉样肽的AD治疗方案屡遭打击，甚至全军覆没，科研学者们开始转向对tau蛋白的深入研究，希望能从tau找到AD等其他相关疾病的突破口。而tau蛋白也没有令大家失望， 向世人展示了它复杂而多变的一面，XX的形态，XX的突变类型，无一不在吸引着着科研学者们去一探究竟。

近年来对于tau蛋白的研究逐渐增多，人们发现tau蛋白的结构形式多样，真正具有毒性的可能并不是NFT，而是从单体逐渐形成NFT过程中的各种中间体，这一发现给研制AD治愈方案带来了新的希望。但是由于中间体并不是单一蛋白，而是各种不同长度不同形态的tau蛋白的混合，给科研带来很大困难，StressMarq提供多种类型和长度的tau蛋白，为AD研究提供有力的工具。 不含肝素的tau 蛋白PFF使用杆状病毒/Sf9细胞表达系统，本身自带30多处磷酸化位点，可以自发聚集形成聚集体，不需要介质诱导。 K18 (0N4R) 异构体表达于人大脑当中. K18 P301L 突变型 tau PFFs （SPR-330）诱导体外 (in vitro) 和活体内 (in vivo) 的 pSer202/pThr205 病理现象. P301L转基因小鼠海马体注射了K18 P301L PFFs 9周之后显示 (pSer202 / pThr205) 病理现象, 可用AT8 Tau 抗体检测到。K18 P301L tau PFFs 大大缩短了转基因小鼠病理现象出现的时间，成功诱导内源tau磷酸化聚集。而P301L转基因小鼠通常9个月才会出现病理现象。

Tau蛋白同样也有寡聚体，我们用花生四烯酸作为诱导剂制备，花生四烯酸在神经元信号传递中有着重要作用，是脑中含量第二高的脂肪酸。 左图为经花生四烯酸短暂孵育的，可见球状tau蛋白寡聚体，右图增加孵育时间可见蛋白的延长，我们期待后续对tau蛋白寡聚体进行更进一步的研究。电镜图来自合作伙伴多伦多大学。