该实验操作指南是将1 型小鼠PFFs (SPR-324) 或1 型人PFFs (SPR-322) 注射到大鼠脑中来产生alpha突触核蛋白病理特征。小鼠PFFs显示出了更强的聚集效果。 使用的动物: 雌性SD (Sprague Dawley) 大鼠。

PFF和单体在注射之前需要超声处理。

16 ug PFFs 或者单体 (阴性对照) 通过以下两个脑顶叶区的头骨位置注射 (每个注射位点16 ug):

• AP + 1.6, ML + 2.4, DV - 4.2
• AP - 1.4, ML + 0.2, DV - 2.8

30天后, 用生理盐水灌注大鼠然后在大鼠脑冠状平面切开，将中脑与前脑分开。之后两部分都用4% PFA 固定 48 小时.  

DAB 操作步骤
材料

• 1X TBS (含有和不含有 TX-100的)
• 30% H₂O₂
• 柠檬酸缓冲液
• 驴血清 (保存在 -20℃; 冻融稳定的)
• 一抗: SMC-600 Alpha Synuclein Antibody (pSer129)
• 二抗: 生物素-SP (long spacer) AffiniPure 驴抗兔 IgG (H+L) (Jackson Immuno; 货号: 711-065-152)
• ABC 试剂 (Vector; 货号: PK-7100)
• DAB 试剂 (Vector; 货号: SK-4100)
• 孔板 (规格取决于要染色的区域数量)
• 漆刷
• 玻璃钩
• 漂白剂
• ddH₂0
• BD Luer-lock 注射器 10 mL
• 过滤器 0.22 uM 孔径 (Fisher 货号. SLMP025SS)
• 100% EtOH
• Histoclear (用于清理组织)
• 显微镜载玻片和盖玻片
• Permount (封片剂)

 第一天:    (猝灭, 抗原修复, 阻断, 一抗) -用 1X TBS (震荡, 室温) 冲洗切片 5 次以除去冷冻保护剂。 -把切片放到 0.6% H₂O₂ 的 TBS 中，覆盖好，置于操作台20分钟。 *该步骤不要用MESH WELLS* 用 _______ mL TBS, _______ uL 30% H₂O₂ -用 1X TBS (震荡, 室温) 冲洗切片3次。 -做抗原修复时, 提前在水浴中预热柠檬酸缓冲液至少15~30分钟。在柠檬酸缓冲液中培养切片一小时，将温度设置为37℃，不要震荡 。 -用 1X TBS (震荡, 室温) 冲洗切片3次。 -阻断时, 将切片置于 5% 常规驴血清和0.25% Triton-100的TBS 中阻断 1 小时，冷室、震荡。 *注意: 可以使用含有Triton的TBS阻断液 (1 L TBS, 2.5 mL TX-100), 之后只需要向阻断液中加入驴血清来阻断。* 用 _______ mL TBS, _______ uL 驴血清, _______ uL 10% TX-100 -用 1X TBS (震荡, 室温) 冲洗切片3次。 -用含 5% 驴血清的 TBS制备一抗溶液，稀释度为 1：5000 或由实验者决定。用锡纸包好切片，和抗体一起在冷室中震荡培养过夜。 用 _______ mL TBS, _______  uL 驴血清, _______ uL pSYN EP1536Y  

第二天:    (二抗, ABC 扩大信号, DAB 染色) -用 1X TBST (震荡，室温) 冲洗切片3次. 余下的步骤中，需要一直将切片保留在锡纸里，即使是冲洗的步骤。 -用含 5% 驴血清的 TBS 制备二抗溶液，稀释度为1：500。在冷室中培锡纸养盖好的切片2小时，震荡。 用 ______mL TBS,  ______ uL 驴血清, _______ uL 生物素标记的驴抗兔 IgG -用 1X TBST (震荡，室温) 冲洗切片3次。 -用 ABC 试剂培养切片 30 分钟 (震荡, 冷室)。 -用 1X TBS 冲洗切片 3 次 (震荡，室温)。 -用 falcon 离心管和 ddH₂O制备 DAB 溶液，每 5 mL H₂O 加入如下溶液然后涡旋混合: 2 滴缓冲溶液 4 滴 DAB 溶液 2 滴H₂O₂溶液 *注意: 所有接触过DAB的器具只能用来操作DAB。我们还在通风橱内准备了一个DAB专用的废液缸。使用玻璃钩来处理DAB溶液中的切片而不能用漆刷，并且操作后要用漂白剂冲洗玻璃钩。盛装过DAB的器皿都需要用漂白剂冲洗并且处理到生物性危害箱中。* -用注射器过滤到新的6孔板中。每一个需要染色的脑切片都用一个新的DAB孔。 -在DAB中培养每个切片直到变为浅棕色 (2-3 分钟就足够; 时间太长可能会造成背景染色太多) -用 ddH₂O 冲洗 3 次 -在 1X TBS 中封片，然后在切片柜中干燥过夜。  

第三天:    (脱水和盖玻片) *注意: 在开始脱水步骤之前，确保浸片用的玻璃皿里有足够的液体可以盖过切片上的所有组织。* -按照如下顺序和时间脱水切片： 1. 30 秒 ddH₂0 2. 3 分钟 70% EtOH 3. 3 分钟 95% EtOH 4. 3 分钟 95% EtOH 5. 3 分钟 100% EtOH 6. 3 分钟 100% EtOH *置于振荡器* 7. 5 分钟 Histoclear 8. 5 分钟 Histoclear 9. 5 分钟 Histoclear -将切片从切片篮从取出，一次一片，置于吸水纸上。 -加封片剂时，取一个P1000 移液器和吸头，将吸头尖剪掉，容量设到400到500 μL. -连续滴几滴封片剂 Permount 到切片的中间，倾斜切片使封片剂完全覆盖切片。 -用棉棒的木头一端赶出切片中的气泡。 -将切片放在吸水纸上，置于操作台上过夜晾干。 *注意: ~24 小时之后, 多余的Permount 封片剂应该用Histoclear移除*